결핵(Mycobacterium tuberculosis, M. tuberculosis 에 의해 유발됨)은
여전히 전 세계적인 보건 위협으로 남아 있으며, 특히 다제내성(MDR) 및
광범위내성(XDR) 결핵균의 유행이 심각한 북한과 같은 고부담 국가에서는
그 위협이 더욱 크다. 본 연구는 이러한 독특한 역학적 환경에서 M.
tuberculosis 의 유전체적 특성과 약제내성 기전을 보다 정밀하게 이해하기
위해 고정확도 롱리드 시퀀싱과 임상 유전체 비교를 결합한 2 단계 접근법을
적용하였다.
우선, PacBio Sequel II HiFi 시퀀싱을 활용하여 북한에서 분리된 약제감수성
임상균주 PSNK363 의 전장 유전체를 de novo 방식으로 조립하였으며, 이를
통해 북한 지역에서 최초의 고품질 참조 유전체를 구축하였다. 해당 유전체는
총 4,422,110 염기쌍으로, 표준 참조균주인 H37Rv 보다 10,578 염기쌍 더
길며, 4,079 개의 단백질 암호화 유전자, 53 개의 tRNA 유전자, 그리고 3 개의
rRNA 유전자를 포함하고 있다. 비교 유전체 분석 결과, PSNK363 에서는
H37Rv 에서 관찰되지 않았던 대규모 염색체 역위(inversion)와 추가적인
유전자 구성이 확인되었으며, 본 유전체는 GenBank 에 등록되어 북한 지역
특이적 참조로 활용될 수 있다.
이어, 이 참조 유전체를 기반으로 2007 년부터 2009 년까지 유진벨재단과
국립마산결핵병원이 수행한 코호트 연구에서 수집된 북한 결핵 환자 3 명의
임상균주 9 개를 대상으로 차세대 시퀀싱(NGS)을 수행하였다. 해당 환자들은
2 년간의 항결핵 치료 과정에서 약제내성을 획득한 사례이며, 모든 균주는
약제 선택압에 대한 적응성이 높은 것으로 알려진 베이징(Beijing) 아계통에
속하는 것으로 확인되었다. 유전체 분석을 통해 fabG1, gyrA, rrs 등의
약제내성 관련 유전자에서 돌연변이가 발견되었고, 모든 환자에서 이질내성
(heteroresistance)이 관찰되어, 숙주 내에서의 동적 진화와 내성·감수성
아형의 공존을 시사하였다.
본 연구는 북한 유래 M. tuberculosis 균주의 최초 참조 유전체를 제공함과
동시에, 항결핵 치료 중 나타나는 약제내성의 출현 및 진화를 추적하는 데
있어 WGS 의 유용성을 입증하였다. 본 연구에서 확인된 돌연변이들은 향후
약제내성 조기 진단을 위한 분자마커로 활용될 가능성이 있으며, 정밀의료
기반의 결핵 치료 전략 수립에 기여할 수 있다. 특히 자원이 제한된 고부담
국가에서 WGS 를 활용한 유전체 감시는 효과적인 결핵 관리 전략 수립에
중요한 기반을 제공할 것으로 기대된다.

"Tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), continues to pose a significant global health challenge, particularly in high-burden regions such as the Democratic People’s Republic of Korea (DPRK), where multidrug-resistant (MDR) and extensively drug-resistant (XDR) strains are of particular concern. To enhance the understanding of genomic features and resistance mechanisms of M. tuberculosis within this distinct epidemiological context, a two-part genomic investigation was conducted, employing high-fidelity long-read sequencing and comparative clinical genomics.

Initially, a high-quality whole-genome reference sequence of a drug-susceptible clinical M. tuberculosis strain, PSNK363, isolated from the DPRK, was generated using PacBio Sequel II HiFi sequencing. The de novo assembly produced a single circular chromosome of 4,422,110 base pairs—10,578 bp longer than the widely used H37Rv reference — and annotated with 4,079 protein coding genes, 53 tRNA genes, and 3 rRNA genes. Comparative genomic analysis revealed the presence of a large chromosomal inversion and additional gene content absent in the H37Rv genome. This reference genome has been deposited in GenBank and is proposed as a DPRK-specific genomic standard for subsequent comparative analyses.

Subsequently, the reference genome was utilized to analyze nine clinical isolates obtained from three DPRK patients who developed drug resistance over a two-year course of chemotherapy, as part of a cohort study conducted by the Eugene Bell Foundation and National Masan TB Hospital between 2007 and 2009. All isolates were classified within the Beijing sublineage, which is recognized for its enhanced adaptability under antimicrobial pressure. Resistance-associated mutations were identified in genes including fabG1, gyrA, and rrs, and heteroresistance was observed in all patients, suggesting dynamic within-host evolution and the coexistence of both resistant and susceptible subpopulations.

This comprehensive genomic analysis represents the first reported reference genome of M. tuberculosis from the DPRK and demonstrates the utility of whole-genome sequencing (WGS) for elucidating the development and progression of drug resistance. The identified mutations may serve as candidate molecular markers for diagnostic applications and early resistance detection. These findings support the implementation of more targeted, individualized treatment strategies and underscore the importance of genomic surveillance in TB control efforts, particularly in resource-limited, high-burden environments."

Abstract i
Introduction 6
Ethics Statement 11
Chapter 1: High-Accuracy Long-Read Sequencing of Mycobacterium tuberculosis PSNK363 Isolated from the Democratic People’s Republic of Korea 13
Abstract 13
1.1 Introduction 15
1.2 Materials and Methods 17
1.3 Results 24
1.4 Discussion 37
Funding Statement 40
References 41
Chapter 2: Microevolution of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from North Korea during long-term treatment 49
Abstract 49
2.1 Introduction 51
2.2 Materials and Methods 54
2.3 Results 62
2.4 Discussion 72
Funding Statement 81
References 82
Abstract (in Korean) 87